殊途能否同归？默克PRMT5抑制剂的改造策略和专利布局

无敌软妹子

蛋白精氨酸甲基转移酶PRMT5在维持细胞稳态中起着重要作用，通过催化100多种核蛋白和细胞质蛋白中精氨酸的对称二甲基化，PRMT5参与了基因表达、核蛋白体生物合成、mRNA剪接、蛋白质翻译、DNA损伤反应和免疫功能调控；PRMT5也是一种必需基因，其完全失活与大多数细胞系的生存是不相容的。PRMT5被证明具有致癌功能，其表达水平在许多实体和血液学恶性肿瘤中失调，这一事件与疾病晚期和不良临床结果相关；因此，PRMT5在肿瘤学中是一个很有吸引力的药物靶点，催化口袋的强效和选择性抑制剂已经被开发出并正在临床试验中。


鉴于PRMT5在正常组织稳态中的重要作用，PRMT5抑制可能有一个有限的治疗窗口。根据医药魔方数据库，目前该靶点尚无分子上市。在《实力靶点PRMT5：合成致死，精准靶向》一文中也探讨了变构抑制剂、共价抑制剂、PROTACS的相关报道，以及安进等选择“合成致死”的策略，本文就分析一下默克选择了PRMT5开发策略的另一条路线——双重抑制剂。


默克的双重抑制策略



2021年，默克公司在JMC杂志中报道了一类5,5-双环核苷类PRMT5抑制剂，用于治疗癌症；活化的PRMT5与适配蛋白MEP50形成杂八聚物，并利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为辅助因子将甲基转移到底物精氨酸上（见图1）；

图1 SAM(绿色，PDB 4X61)与PRMT5结合模式，黄色虚线显示主要作用

酶的活性位点由一个保守的SAM结合口袋和附近的一个蛋白质底物结合口袋组成，这两个结合口袋由酶内一个短而窄的通道连接；除了SAM外，内源性配体甲基硫代腺苷(MTA)也以SAM竞争的方式结合并抑制PRMT5，鉴于PRMT5的催化位点结构特征，有三种最常见的抑制剂类型：包括SAM竞争性、底物竞争性和双重SAM/底物竞争抑制剂；双重SAM/底物竞争抑制剂占据SAM口袋，并延伸到连接底物蛋白质口袋的狭窄沟槽，这种抑制SAM、底物与PRMT5酶结合的机制可以用来设计抑制剂，这种策略可以提高药效，延长化合物的停留时间。默克公司开发的目标是：强效、高选择性、口服生物利用度高和低预测的人给药剂量的核苷衍生物的PRMT5抑制剂。


图1中，SAM结构中的二醇与Tyr324和Glu392形成氢键，嘌呤C6 -氨基基团与Asp419氢键连接，嘌呤N1 -氮氢键与Met420的主链酰胺?NH形成氢键。根据这些关键结合信息，默克公司根据之前开发的SAM mimetic化合物JNJ64619178来改构，它包含一个氨基喹啉片段，建模表明，它可以从SAM结合口袋延伸到肽结合位点通道；氨基喹啉被特别模拟成与Glu444形成双齿氢键，类似于底物精氨酸残基，因此可阻止PRMT5蛋白与SAM及底物的结合，达到双重抑制剂（SAM/底物）的目的。


默克的化合物设计旨在开发新的核苷类和可与glu444相互作用的取代基。在五元环上羟基的α位引入甲基得到JNJ64619178的类似物3（图2），通过PRMT5 target engagement (TE) assay实验得到的EC50为4 nM，表明此处羟基位置可以耐受有位阻的甲基，进一步的构象约束环合，释放一部分张力得到的化合物，其EC50为1nM。根据化合物4的x射线晶体结构（图2 B），核苷二醇和碱基保留了模拟SAM中腺苷部分的关键氢键相互作用（作为SAM抑制剂），此外，氨基喹啉部分确实可以延伸到连接SAM与底物的口袋，与Phe327形成face-to-face的π堆积相互作用，与Glu444形成双齿氢键（作为底物抑制剂），这些都证实了4为双竞争抑制剂。

图2 （A）融合3 '和4 '，设计的5,5双环骨架；（B）4的几个关键核苷结合药效基团

图3 5, 5-双环核糖的SAR

5, 5-双环核糖SAR探讨：默克公司主要考察了氧和亚甲基作为连接链时双环核糖的构效关系，并对嘌呤的NH2进行了甲基、环丙基、H的基团替换，氨基喹啉片段中对氨基的邻位考察了不同卤素取代和甲基、H取代的情况，从图3中可看出化合物37、44、45表现出优异的活性，氨基喹啉片段邻位卤素电性因素的影响大于位阻因素，氟取代时（氨基喹啉氮的碱性强）有利于与Glu444形成双齿氢键。


但是C6位氨基取代系列的PK和溶解度测试表明（图4），化合物4和29~33的大鼠生物利用度均比较差，较好的化合物33也只有28%；氧原子为连接链时，溶解度差，而当氨基喹啉的邻位是F取代、亚甲基作为双环的linker时，溶解度有很大改善。

图4 C6 -氨基碱基类似物的PK和溶解度

C6 -甲基碱基取代系列中（图5），大鼠的生物利用度有了很大提高，其中化合物35的生物利用度提高至71%。但是MRT（Mean Residence Time）、溶解度和CYP3A4的RI（可逆抑制）和TDI（time-dependent inhibition）等仍有改进空间。

图5 C6 -甲基碱基类似物的PK和溶解度

目前的改造，仍未获得一个高亲和力、良好的PK(高F %和长MRT > 2h)、合适的溶解度(≥50 μM)和低风险的CYP3A4介导的DDI（药物药物相互作用）的化合物。因此默克公司又开发了一类全碳的5,5双环类似物。


图6列出了一些全碳5,5双环类似物的数据，比较66 ~ 68，当C6是甲基取代而非氨基时可以提升生物利用度，这类全碳抑制剂的溶解度也很好，符合?F >?Cl >?Br的趋势(尤其是pH值为7时)；大多数化合物的清除率和MRT值也保持合理的范围内，尽管%F保持适中，71和72显示了该系列的潜力，其MRT值≥2.5 h (在双环核糖化合物中未见)，喹啉环上的氟取代并没有帮助提高%F，它可能封闭了氨基喹啉片段中的代谢位点，导致较低的清除和较高的MRT值。

图6 全碳5,5-双环类似物PK和溶解度

综合考虑，个位数纳摩尔的活性、高F %和优异的溶解度，以及合适的PK，使得该全碳双环成为一个比较有潜力的骨架。具有代表性的化合物68在off-target选择性实验中也显示出良好的脱靶选择性，该系列中的所有化合物也具有降低的CYP3A4介导的DDI药物风险，因为它们的可逆或时间依赖性抑制倾向降低。其中，化合物72是一个非常突出的化合物 (TDI比=1.0)。考虑到它的低纳摩尔活性，以及优异的PK(低清除率，>2h MRT) 及在多个种属中数据一致，化合物72具有平衡的理化性质，与低的QD（一天一次）人体剂量预测和最小的DDI（药物药物相互作用）风险。

图7 全碳双环PRMT5抑制剂人体剂量预测（化合物72）

默克公司最终发现了化合物72，这一具有良好PK、高溶解度、低DDI风险和低预测人体剂量的双环核苷类似物，目前作为lead处于临床前评价中。（该篇JMC接收时间为2020年12月份），此后默克公司至少仍申请了4篇WO专利（不同结构类型）。


默克的相关专利布局



在欧洲专利局数据库中检索PRMT5的关键词，查询默克公司关于PRMT5抑制剂的专利，共找到10篇化合物专利和一篇Biomarker相关专利（表1），其中专利WO2020033288已经进入中国，且实施例24中的化合物即为该篇JMC中的化合物72，之后默克公司仍公开了其他结构类型的PRMT5抑制剂，如咪唑并[1,2-a]吡啶（共4篇专利，包含两篇特殊化合物专利）。

默克公司PRMT5抑制剂的相关专利

专利WO2021126731中的化合物1b是根据GSK-3326595（处于二期临床）来改构的，两个氘原子的引入可能是为了封闭代谢位点（N的α位有苄基氢）；由于PRMT5抑制可能有一个有限的治疗窗口，笔者猜测化合物72可能治疗窗口有限，安全性仍不够，因而新结构仍在继续寻找优化中；根据医药魔方数据库，目前默克公司尚无分子报临床，两篇特殊化合物专利中的分子值得跟踪研究，由于专利中只公开了活性数据，PK数据、体内数据、安全性数据均未公开，笔者推测WO2021126732中实施例3的分子值得关注，也许会继续往前，推进临床。


总结和展望



安进公司（AMG193）和Mirati公司（MRTX1719）的合成致死抑制剂也是令人期待的方向，这种策略带来的优势包括：高选择性靶向MTAP基因缺失的癌细胞，对正常细胞影响小，同时提高治疗指数（TI）；默克公司开发的双重SAM/底物抑制剂目的在于提高药效、延长化合物的停留时间，从而降低给药剂量，提高TI。


从这点看，两种策略是殊途同归的。而初代的PRMT5抑制剂的一个主要缺陷正是治疗指数狭窄。但合成致死类抑制剂针对的适应症是MTAP基因缺失的癌症，这与SAM/底物的双重抑制剂针对的适应症有差别，适应症的差异化也是新药能否成功上市的关键影响因素之一，期待PRMT5抑制剂能够早日上市，造福患者。


参考文献：
[1]Michelle R. Machacek etal; The Discovery of Two Novel Classes of 5,5-Bicyclic NucleosideDerived PRMT5 Inhibitors for the Treatment of Cancer; J. Med. Chem. 2021, 64, 3911?3939;
[2]Alessandra Ianari etal; Discovery of a First-in-Class Inhibitor of the PRMT5?Substrate Adaptor Interaction; J. Med. Chem.2021, 64, 11148?11168；
[3] 默沙东公司;PRMT5抑制剂; CN112805006 A;
[4] 欧洲专利局数据库；
[5] https://clinicaltrials.gov/ct2/home。
[6] 医药魔方数据库；
[7]AACR-NCI-EORTC 2021: MRTX1719: A First-in-class MTA-cooperative PRMT5 Inhibitor that Selectively Elicits Antitumor Activity in MTAP/CDKN2A Deleted Cancer Models;

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